Understanding and harnessing chaperone-mediated autophagy (CMA) in the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)
Comprendre et exploiter l'autophagie médiée par les protéines chaperonnes chez la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss)
Résumé
Chaperone-mediated Autophagy (CMA) is a prominent lysosomal-dependent pathway responsible for protein degradation, maintaining cellular proteostasis in the face of various stressors like starvation, oxidative stress, and hypoxia. While extensively studied in mammals, CMA's existence in fish has only been confirmed recently, offering exciting insights into its role in species facing environmental stress.In this PhD thesis, I first investigated the evolutionary lineage of key elements within CMA to uncover indications that CMA might exist in the rainbow trout (RT, Oncorhynchus mykiss). The preliminary overview of CMA main actors across vertebrate evolution unmistakably highlighted the potential for a functional CMA in the RT. CMA's rate-limiting factor, the lysosome-associated membrane protein 2A (Lamp2A) appeared at the onset of vertebrate radiation, de facto indicating that CMA is specific to this lineage. However, we found a high sequence variability within the different functional domains of Lamp2A between phylogenetically distant vertebrates, which potentially suggests that CMA function has evolved differently between species.Subsequently, my objective was to characterize the mRNA expression of CMA-related genes throughout the developmental stages as well as within the adult tissues of RT. The results showed that RT has all the genetic material to express CMA machinery, particularly in tissues involved in major metabolic processes.In order to firmly establish the existence of functional CMA activity in this species, we then performed an in vitro CMA activity assay using isolated lysosomes. Our results revealed that RT undoubtedly exhibits CMA activity, which increases 21-fold during nutrient deprivation, a known CMA inducer. Finally, we used the CRISPR-Cas9 genome editing tool to generate a knock-out (KO) line lacking Lamp2A. Lamp2A KO fish showed significant physiological alterations, including enhanced body size and altered organ indices, as well as substantial remodeling of the liver proteome.As CMA in mammals is involved in the maintenance of cellular homeostasis, we anticipated that a similar role could be encountered in RT. As such, we used the ‘CMA score', a reliable indicator of the activation status of CMA based on the expression levels of key CMA effectors and regulators to assess cellular stress in RT, and potentially other fish species. An in vitro study involving RT cell lines subjected to different known CMA triggers was addressed, as CMA activity can be quantified using a KFERQ-PA-mCherry1 CMA reporter, a widely utilized method in mammalian cells. Finally, we explored tissue-specific variations in the CMA score response to Hg exposure and found an organ-specific activation of the CMA machinery. These findings emphasize the purpose of using the CMA score as an indicative marker for cellular homeostasis in organisms currently exposed to environmental threats but also enables the assessment of CMA potential in emerging models.
L'autophagie médiée par les chaperonnes (CMA) est une voie cellulaire responsable de la dégradation des protéines, assurant l'homéostasie cellulaire face à divers stress tels que le jeûne, le stress oxydatif et l'hypoxie. Bien que largement étudiée chez les mammifères, l'existence de la CMA chez les poissons n'a été confirmée que récemment, offrant des perspectives passionnantes quant à son rôle chez les espèces confrontées au stress environnemental.Dans cette thèse de doctorat, j'ai d'abord examiné les particularités évolutives des éléments clés de la CMA pour déceler des indications de l'existence possible de la CMA chez la truite arc-en-ciel (RT, Oncorhynchus mykiss). Les résultats montrent que les acteurs principaux de la CMA au cours de l'évolution des vertébrés sont présents et pourraient potentiellement être fonctionnels chez la RT. Le facteur limitant de la CMA, la protéine membranaire associée au lysosome 2A (Lamp2A), est apparu au début de la radiation évolutive des vertébrés, indiquant ainsi que la CMA est spécifique à cette lignée. Cependant, nous avons constaté une grande variabilité de séquence dans les différents domaines fonctionnels de Lamp2A entre les vertébrés phylogénétiquement éloignés, suggérant potentiellement que la fonction de la CMA a évolué différemment entre les espèces.Par la suite, mon objectif était de mesurer l'expression de l'ARNm des gènes liés à la CMA tout au long des stades de développement ainsi que dans les tissus adultes de la RT. Les résultats ont montré que la RT possède tout le matériel génétique nécessaire pour exprimer la machinerie de la CMA, en particulier dans les tissus impliqués dans les processus métaboliques majeurs.Afin d'établir fermement l'existence d'une activité fonctionnelle de la CMA chez cette espèce, nous avons ensuite réalisé une étude in vitro en utilisant des lysosomes isolés. Nos résultats ont révélé que la RT présente indubitablement une activité CMA, qui augmente 21 fois lors du jeûne, un inducteur connu de la CMA. Enfin, nous avons utilisé l'outil d'édition du génome CRISPR-Cas9 pour créer une lignée déficiente en Lamp2A. Les poissons Lamp2A KO ont montré des altérations physiologiques significatives, notamment une augmentation de la taille et du poids corporels, ainsi qu'un remodelage substantiel du protéome hépatique.Étant donné que la CMA chez les mammifères est impliquée dans le maintien de l'homéostasie cellulaire, nous avons anticipé qu'un rôle similaire pourrait être observé chez la RT. À cet égard, nous avons utilisé le 'CMA score', un indicateur fiable de l'état d'activation de la CMA basé sur les niveaux d'expression des effecteurs clés et des régulateurs de la CMA, pour évaluer le stress cellulaire chez la RT, et potentiellement chez d'autres espèces de poissons. Une étude in vitro impliquant des lignées cellulaires de la RT soumises à différents activateurs connus de la CMA a été réalisée, car l'activité de la CMA peut être quantifiée en utilisant un rapporteur de la CMA KFERQ-PA-mCherry1, une méthode largement utilisée chez les cellules de mammifères. Enfin, nous avons exploré les variations spécifiques aux tissus dans la réponse du CMA score à l'exposition au mercure (Hg) et avons constaté une activation spécifique de la machinerie CMA en fonction des organes. Ces découvertes mettent en évidence l'utilité du CMA score en tant que marqueur indicatif de l'homéostasie cellulaire chez les organismes actuellement exposés à des menaces environnementales, tout en permettant l'évaluation du potentiel CMA dans les modèles émergents.
Domaines
Biologie cellulaire| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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